Основы генетической инженерии

Страница 2

Биотехнология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор, как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие:

Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов (сайт-спецефический мутагенез и т.д.) и затем внедрять их в клетки или организмы.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4–6 нуклеотидов (сайт узнавания). Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определять последовательность нуклеотидов) любых очищенных фрагментов ДНК[8]. В середине 70-х г. в этой области произошел решительный перелом, связанный с открытием рестриктаз и усовершенствованием метода гель-электрофореза, когда стало возможным разделять достаточно протяженные фрагменты ДНК, отличающиеся размером всего на один нуклеотид. С помощью рестриктаз ДНК стали разрезать на определенные блоки и определять в них позиции нуклеотидов химическими (А. Максам и У. Гилберт 1976) или энзиматическими (Сангер и Коулсон 1975) методами.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100ºС в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100ºС комплементарные пары оснований разрушаются, и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65ºС приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»).

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro.

Для эффективного введения (трансформации) необходимо иметь достаточное число копий нуклеотидных последовательностей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей (генов). Метод был предложен в 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация «Cetus», США) и получил широкое распространение в 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликована основополагающая работа по теории ПЦР и её оптимизации. Метод ПЦР, названный «изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевской премией, ускорил реализацию программы «Геном человека», а также способствовал внедрению в практику клинической диагностики многих заболеваний высокоэффективных диагностических наборов нового поколения.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразу), которая в присутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20–30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. ПЦР имеет циклический, включающих нагревание и охлаждение проб, и цепной характер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30–40 раз, за 1,5 – 3 ч получают миллионы копий фрагментов ДНК.

Страницы: 1 2 3 4 5 6 7

Информация по педагогике:

Сущность и цель образования
При раскрытии этих ведущих философско-педагогических понятий Дьюи продолжает гуманистическое направление, заложенное Руссо. Идея великого швейцарца об образовании как процессе естественного роста является исходной для Дьюи. Он полностью разделяет положение Руссо о том, что «истинное образование ест ...

Теории и основные подходы к изучению девиантного поведения
Проблема девиантного поведения изучается давно, но, несмотря на это в современном мире она не становится менее актуальной. Предпосылки изучения девиантного поведения были заложены еще в древности. Научный интерес к категории «поведение» проявлялся уже в античности, когда Демокрит, Сократ, Платон, А ...

Н.К. Крупская о воспитании нового человека
В своих статьях и выступлениях Надежда Константиновна отстаивала и пропагандировала программу борьбы за новую, социалистическую школу, которую выдвинула партия, разъясняла в них ленинские принципы связи школы с политикой, единства трудовой школы, ее светскости, разрабатывала вопросы патриотического ...

Дистанционное обучение

Дистанционное обучение

Дистанционную форму обучения специалисты по стратегическим проблемам образования называют образовательной системой 21 века.

Навигация

Copyright © 2020 - All Rights Reserved - www.easilyeducation.ru