Основы генетической инженерии

Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973). Его источником была плазмида E. coli R6-5 c Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз (рис. 3).

Рис. 3. Схема использования плазмиды pBR322 для отбора клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды.

Возможности плазмид для генетической инженерии не беспредельны, что связано с их небольшими размерами. Когда нужно клонировать крупные фрагменты ДНК, удобнее использовать векторы на основе бактериофага λ. Геном фага λ досконально изучен. В центральной части линейного генома фага содержится область, необязательная для литической инфекции, которую и используют для вставки клонируемой ДНК. ДНК фага λ разрезают с помощью рестриктазы Eco RI, удаляют необязательную центральную область и на её место встраивают нужный фрагмент ДНК, получая, таким образом, конкамер – предшественник для упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы. Фаг λ очень пластичен: без нарушения развития фага из него можно убрать до 25% ДНК или пристроить до 6% лишней ДНК. В этот фаговый вектор можно встраивать до 23 000 н.п.

В тех случаях, когда не хватает возможностей фага, используют ещё более крупные векторы – космиды. В состав космид входят: ген (маркер) резистентности к антибиотикам, репликон плазмиды и фрагмент ДНК фага λ (так называемый cos-участок). Этот фрагмент представляет собой однонитевые комплементарные участки на концах фаговой ДНК, т.е. «липкие концы».

Ещё один вид векторов – фазмиды, искусственные гибриды между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК они в одних условиях могут размножаться как фаги, а в других – как плазмиды.

Векторы на основе нитевидных фагов применяют тогда, когда удобнее работать с одной цепью ДНК. Так, фага М13 и fd содержат кольцевую одноцепопочечную ДНК с полностью изученными последовательностями нуклеотидов.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae представляют собой перспективные модели для экспериментов с рекомбинантными ДНК. Их гаплоидный геном содержит 1,4 х 107 н.п. (в 3 раза больше, чем у E.coli), распределенных по 17 хромосомам. Дрожжи не инфицируются вирусами, но в их клетках выявлена плазмида, используемая в качестве вектора – 2 мкм-плазмидная ДНК. Важной особенностью дрожжевых систем является то обстоятельство, что клонируемые фрагменты ДНК способны к рекомбинации с гомологичными участками дрожжевого генома, что ведет к стабильной сайт-специфической трансформации последнего (независимо от сохранения или утраты вектора).

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями(CaCl2), обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение её от общей массы возможно также в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5–10 бактерий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Информация по педагогике:

Анализ интеллектуальных умений умственно отсталых воспитанников в процессе осуществления заданий по ручному труду
Для проведения коррекционной работы требуется специально организованная предметно- пространственная развивающая среда: функциональные и ориентированные игрушки и пособия для развития сенсомоторных функций, пособия и материалы для развития мелкой моторики, кабинет труда должен быть оснащен по аналог ...

Основные характеристики кредитно-модульной системы
КМС – ориентированная на студента система для накопления и передачи кредита, основана на прозрачности результатов и процессов обучения. Эта система нацелена на облегчение планирования, хода, развитие, признание и соответствие квалификаций и модулей обучения, так же как и на студенческую мобильность ...

Основные приемы коррекции представлений умственно отсталых детей об окружающем мире
Одним из важнейших направле­ний коррекционно-развивающей ра­боты психолога является формирова­ние представлений об окружающем мире. Их недостатки у детей с нару­шениями интеллектуального разви­тия общеизвестны. Улучшение ка­чества таких представлений — одна из предпосылок успешной социали­зации. Пр ...