Основы генетической инженерии

Лигазная цепная реакция проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используется термостабильная ДНК-лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к амплифицируемому фрагменту ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов.

NASBA-метод (Nucleic Acid Sequence – Base Amplification), разработанный в последние годы, является наиболее универсальным методом амплификации как ДНК, так и РНК. Этот метод, в отличие от ПЦР, является изотермальным и осуществляется при 41ºС. Основными компонентами NASBA-системы являются РНК-полимераза фага Т7, РНКаза Н (гидролизует РНК в составе гибрида РНК:ДНК, но не атакует свободную ДНК) и обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза. В систему входят также нуклеозидтрифосфаты и два специфических праймера, один из которых содержит участок, представляющий собой последовательность (промотор), распознаваемую РНК-полимеразой.

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК – лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК – лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов.

Сшивание генов (фрагментов) (рис. 1) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4–6 пар нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами:

– – А Т Г Ц А А Т Т Ц А Г Т Ц – – – – – –

Т А Ц Г Т Т А А Г Т Ц А Г – – – – – –

Сшивание ДНК-лигаза

А Т Г Ц А А Т Т – Ц А Г Т Ц

Т А Ц Г – Т Т А А – Г Т Ц А Г

Рис. 1. Сшивание генов

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем (коннекторный метод получения гибридных молекул ДНК), используя концевую (терминальную) дезоксинуклеотидилтрансферазу из тимуса теленка или поли(А) – полимеразу E.coli.

Также, для стыковки фрагментов применяют так называемые линкеры (рис. 2) (или «переходники») – короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:

– А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г

Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц

Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2

Рис. 2. Объединение фрагментов линкерами

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем, часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплицирваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:

Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции.

Иметь свойства репликона.

Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д. Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют стабильно наследуемые бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности). Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более ста.

Информация по педагогике:

Основные понятия оздоровительной направленности физического воспитания дошкольников
Современное общество отличается многообразием примеров образа жизни человека, с которыми постоянно сталкивается каждый ребенок. Это многообразие не всегда является образцом для ребенка, в результате создается хаотичность в представлениях ребенка о здоровом образе жизни и разрушаются уже сложившиеся ...

Семейные факторы, влияющие на развитие ребенка
Родительское воспитание при определенных условиях может быть неблагоприятным когда ребенок воспитывается одним родителем, приемными родителями, отчимом или мачехой, родственниками, чужими людьми, а также родителями при непостоянном с ними проживании. Воспитание в неполной семье, в частности, станов ...

Основы биологической переработки отходов
Специфическое применение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких, как переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений, составляет предмет экологической биотехнологии. Получение биогаза Биогаз – это смесь из 65% метана, 30% СО2, 1% сероводорода. Энергия, закл ...