Основы генетической инженерии

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологический метод Брума–Джилберта) . Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн – Хогнесс). (рис. 4).

Рис. 4. Метод радиоавтографии в применении к поиску рекомбинантных клонов[14].

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название «шотган» (от англ. shotgun – дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды E.coli, «раскрытые» (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом.

Другой подход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании на мРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК) .Теперь специфическую мРНК, кодирующую белок, ген которого надо получить, можно использовать в качестве матрицы для ферментативного синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). (рис. 5).

После расщепления гибрида ДНК-РНК, используя видоизменённую протеазами ДНК-полимеразу E.coli – фрагмент Клёнова, синтезируют двухцепочечную ДНК.

После расщепления «шпильки» остается синтетическая двуцепочечная кДНК, соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е. вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущих генам большинства эукариотических белков. И для экспрессии такого гена в клетках прокариот необходимо, чтобы он находился под контролем прокариотических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии соответствующая кДНК присоединяется к регуляторным элементам бактерии-промотору, оператору и рибосом-связывающему участку.

На современном этапе также возможен химико-ферментативный синтез полинуклеотидных последовательностей. Синтез гена впервые был осуществлён в 1970 году в лаборатории Х.Г. Кораны.

Рис. 5. Схема подготовки кДНК для клонирования.

Клонирование и экспрессия генов в различных организмах

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений[7]. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомиценами и Sacchromyces cerevisiae.

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм.

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету.

Информация по педагогике:

Химические и химико-физические свойства бериллия
Бериллий (Be) - имеет атомный номер 4 и атомный вес 9.0122. Он находится во втором периоде периодической системы и возглавляет главную подгруппу 2 группы, в которую также входят магний, кальций, стронций, барий и радий. Электронная структура атома бериллия 1s 2s. На внешней оболочке он имеет два эл ...

Личностные особенности часто болеющих детей
Развитие ребенка в условиях заболеваний влияет на формирование его личности. Понятию "Я" у таких детей соответствует отрицательный образ, они сопровождают его отрицательным по смыслу комментарием, за ним скрывается неприятие себя, недовольство своей внешностью, низкая самооценка. Для сома ...

Состояние вопроса в современной российской школе
Для осознанного понимания химических процессов огромное значение имеет представление о химических элементах. Эти вопросы всегда были самыми сложными не только для учащихся, но и для учителей. Учебный материал темы поделен на 4 урока, поскольку давно известно, что на одном уроке нельзя ознакомить уч ...